維生素B12測定用培養(yǎng)基，不含維生素B12，但包含所有其他維生素和必要養(yǎng)分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC7830）的生長。萊士曼乳酸桿菌（ATCC7830）作為測定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美國藥典和美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）所推薦（2，3）。

　　

　　用已知稀釋度的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（2，3）。

　　

　　測試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，推薦在37°C孵育24小時，再離心、清洗、重懸于10ml生理鹽水中，再通過濁度分析或酸度分析，確定生長反應(yīng)。

　　

　　用維生素B12的濃度及對應(yīng)的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定待測樣本中的維生素B12的濃度。

　　

　　維生素測定培養(yǎng)基的操作方法

　　

　　(1)試樣處理

　　

　　①皂化：準(zhǔn)確稱取1～10g試樣(含維生素A約3μg，維生素E各異構(gòu)體約為40μg)于皂化瓶中，加30mL無水乙醇，進(jìn)行攪拌，直到顆粒物分散均勻為止。加入5muO％抗壞血酸、苯并[P]芘標(biāo)準(zhǔn)液2.OOmL，混勻，加10mL氫氧化鉀溶液(1+1)，混勻。于沸水浴回流30min，使皂化*。皂化后立即放入冰水中冷卻。

　　

　?、谔崛。簩⒃砘蟮脑嚇右迫敕忠郝┒分?，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，用約100mL乙mi分兩次洗皂化瓶及其殘渣，乙mi液并入分液漏斗中。如有殘渣，可將此液通過有脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗中。輕輕搖動分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。

　　

　　③洗滌：用約50mL水洗分液漏斗中的乙mi層，用pH試紙檢驗直至水層不顯堿性(初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加)。

　　

　　④濃縮：將乙mi提取液經(jīng)過無水硫酸鈉(約5g)濾入與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250～300mL球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約100mL乙mi沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓并回收乙mi，待瓶中剩下2mL乙mi時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹掉乙mi，立即加入2.OOmL乙醇，充分混合，溶解提取物。

　　

　　將乙醇液移入一小塑料離心管中離心5min(5000r/min)。上清液供色譜分析。如果試樣中維生素含量過少，可用氮氣將乙醇液吹于后，再用乙醇重新定容，并記下體積比。